PRODUÇÃO DO HORMÔNIO DE CRESCIMENTO (GH) DE BOS TAURUS PELA LEVEDURA PICHIA PASTORIS UTILIZANDO UMA SEQÜÊNCIA GÊNICA SINTÉTICA

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Abstract

PRODUÇÃO DO HORMÔNIO DE CRESCIMENTO (GH) DE BOS TAURUS PELA LEVEDURA PICHIA PASTORIS UTILIZANDO UMA SEQÜÊNCIA GÉNICA SINTÉTICA. O objeto da presente invenção trata da produção do hormônio de crescimento bovino recombinante (rbGH) utilizando como sistema de expressão a levedura P. pastoris. A inovação está focada na utilização de uma sequência gênica sintética que utiliza códons preferenciais e conteúdo otimizado de bases nucleotídicas GC para P. pastoris. O processo de produção do bGH recombinante utilizando como sistema de expressão a levedura P. pastoris compreende: (a) síntese do cDNA codificador do GH bovino (Bos taurus taurus) utilizando como referência as sequências gênicas descritas no GenBank (gi:2168581, gi:2168481, gi:2168363) considerando as seguintes alteraçôes: (1) Adaptação da seqúência sintetizada do referido hormônio para os códons preferenciais da levedura P. pastoris e otimização do conteúdo de bases nucleotídica GO; (II> Inclusão de sítio de restrição Xhol na extremidade 5', e de Xbal, na extremidade 3', com a finalidade de facilitar o processo de clonagem gênica em vetor de expressão; (III) Adição de sequência de nucleotídeos que codifiquem para 6 resíduos de aminoácidos na extremidade 5' imediatamente upstream da seqúência codante do bGH, e adição de um stop codon downstream à sequência; (b) Clonagem do gene sintetizado em vetor de expressão/secreção para P. pastoris (pPICZ A) utilizando metodologias de biologia molecular; (c) Transformação da linhagem de P. pastoris GSII5 para expressão extracelular de bGH; (d) Cultura celular de levedura em frascos aletados de 1 L para expressão do hormônio de crescimento; (e) Avaliação da expressão do hormônio de crescimento através de Western Blotting; (f) Quantificação da eficiência de expressão do hormônio de crescimento recombinante por teste de Bradford e densitometria de gel.