MÉTODOS DE MODIFICAR O MATERIAL GENÉTICO DE UMA CÉLULA EUCARIÓTICA E DE UM ORGANISMO, VETOR DE EXPRESSÃO DE POLINUCLEOTÍDEO, E, CÉLULA PROCARIÓTICA

IPC Classification

Priority claims

Abstract

Um polinucleotídeo codificando uma proteína ThermoCas9 de Geobacillus thermodenitrificans e um promotor constitutivo são usados para engenheirar células eucarióticas, por exemplo fungos, leveduras ou algas, de modo que a endonuclease ThermoCas9 é integrada e expressada a partir do genoma da célula. Então, um segundo plasmídeo de expressão é usado para transfectar estas células expressando ThermoCas9, o segundo plasmídeo contendo um promotor induzível e um polinucleotídeo codificando um RNA guia. O RNA guia combina com o ThermoCas9 para fornecer a atividade de endonuclease alvo-marcada para clivar o DNA da célula em um local desejado ou gene de interesse. Um oligo de reparação é também fornecido à célula, por meio do que, após a clivagem de DNA, recombinação homóloga ocorre na célula com o oligo de reparação de modo que uma deleção ou uma substituição de nucleotídeos no local ou gene de interesse é obtida. Vetores de expressão e métodos de usar os vetores para obter uma edição de gene mediada por ThermoCas9 são descritos, por meio do que temperaturas mais elevadas, por exemplo superiores a 30°C, são usadas.