SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA DE UM INIBIDOR DE PROTEASES DO TIPO KUNITZ OBTIDA  A PARTIR DE UMA BIBLIOTECA DE CDNA DE GLÂNDULAS SALIVARARES DE CARRAPATOS AMBLYOMMA CAJENNESE USO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE

Classificação IPC

Resumo técnico

"PROCESSO DE OBTENÇÃO DE UM INIBIDOR DE PROTEASES DO TIPO KUNITZ A PARTIR DE UMA BIBLIOTECA DE CDNA DE GLÂNDULAS SALIVARES DO CARRAPATO AMBLYOMMA CAJENNENSE: SEQÜÊNCIA DE OLIGONUCLEOTÍDEOS DO CLONE, E SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA PROTEÍNA RECOMBINANTE, PROTEÍNA RECOMBINANTE; PROCESSO PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE INIBITÓRIA SOBRE O FATOR X ATIVADO, PROCESSO PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICOAGULANTE EM PLASMA, PROCESSO PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE APOPTÓTICA EM LINHAGENS DE CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS E MURINAS, PROCESSO DE DETERMINAÇÃO DE ATIVIDADE ANTI-METASTÁTICA EM TUMOR DE MELANOMA, PROCESSO DE DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-CÂNCER, IN VITRO E IN VIVO, USO DO RECOMBINANTE EM DIFERENTES MECANISMOS HOMEOSTÁTICOS (COAGULAÇÃO E RESPOSTA IMUNOLÓGICA) , ANTI-PROLIFERATIVOS, ANTI-APOPTÓTICOS E ANTI-ANGIOGÊNICOS". Trata-se a presente invenção de um inibidor recombinante do tipo Kunitz que foi obtido a partir de um gene clonado de uma biblioteca de cDNA das glandulas salivares do Amblyomma cajennense, e o inibidor denominado Amblyomin-X apresenta massa molecular da ordem de 13.500 Da. O Amblyomin-X quando testado sobre o FXa utilizando o substrato colorimetrico especifico para o FXa, inibe o FXa e a inibição mostrou-se dependente da presença de fosfolipideos (Fosfatidilserina : Fosfatidilcolina). A atividade inibitória do Amblyomin-X foi verificada também nos testes de coagulação, sendo avaliados o tempo de tromboplastina parcial ativado (TTPA ), o tempo de protrombina (TP) e o teste PCA - pro coagulant activity assay. A presença de 7,5 uM do inibidor prolonga cerca de 3 vezes TTPA; aproximadamente 6 vezes o TP, e também prolonga cerca de 2 vezes o PCA, sendo que este ensaio foi realizado tanto na presença de fosfatidilserina : fosfatidilcolina como na presença de corpos apoptóticos (produzidos a partir de células CHO) como fonte de fosfolipídeos. O tratamento in vitro das linhagens tumorais B16F10, SW12A1, B3, L292, MCF7, HL60, K562, U937 e JURKAT com o Amblyomin-X demonstrou que o inibidor exerce um efeito apoptótico de maneira tempo e dose dependente nestas células. Nenhum efeito foi observado em células normais de fibroblastos humanos, macrófagos, neutrófilos e linfócitos. Camundongos (C57BL/6J) portadores de melanomas dorsais que receberam Amblyomin-X (1mg/kg) durante 12 dias apresentaram redução significativa da massa tumoral e do número de metastases quando comparados a um grupo de animais portadores do tumor e não tratados. Além disso, camundongos (C57BL/6J) portadores de metastases no pulmão, que foram tratados com Amblyomin-X (1mg/kg) durante 12 dias apresentaram redução no número de nódulos tumorais no parênquima pulmonar quando comparados a um grupo com tumor não tratado. O tratamento, por via subcutânea, de camundongos (C57BL /6J) portadores de melanoma, com 42 doses de Amblyomin-X (1mg/kg), mostrou que o inibidor é capaz de fazer a remissão completa do tumor, impedir metastases e não causar alterações hematológicas nos animais, mantendo o hemograma semelhante ao de um grupo de animais sadios. A análise do ciclo celular dos tumores dorsais de animais tratados com Amblyomin-X mostrou uma grande parte das células tumorais em apoptose, quiescentes e com baixa capacidade proliferativa. As células obtidas de metastases pulmonares encontram-se em grande parte na fase G2/M incapazes de se dividir. A atividade funcional de macrófagos obtidos de animais portadores de tumor dorsal e tratados com Amblyomin-X mostrou que a droga aumenta a capacidade fagocitária destes macrófagos mediada por C3B e pelo receptor FC. Assim, o Amblyomin-X além de um inibidor do FXa, também é eficaz no tratamento alvo de neoplasias malignas.