MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR A FORMA ATIVA DA DOENÇA DE CHAGAS USANDO GLICOCONJUGADOS DO TIPO MUCINA

IPC Classification

Abstract

A presente invenção se refere a um processo de preparação de antígenos glicoconjugados do tipo mucina, provenientes de formas tripomastigotas de Trypanosoma cruzi, bem como o método de utilização destes antígenos para diagnosticar a forma ativa da Doença de Chagas. O processo consiste das etapas de liofilização dos parasitas; extrações, em etapas diferentes, com solventes orgânicos; obtenção dos glicoconjugados do tipo mucina mais fosfolipídeos contaminantes; partição butanólica; cromatografia de interação hidrofóbica e armazenagem dos glicoconjugados purificados. O método para diagnosticar a Doença de Chagas consiste das seguintes etapas: a) adição e fixação de 1 a 20 nanogramas de antígenos glicoconjugados em placas de ELISA de 96 poços para reações imunoenzimáticas, por 2-18 horas e 4-37°C; b) bloqueamento das placas por 1-18 horas e 4-37°C; c) adição de 50 a 200 µl de soros humanos ou soros-controles, numa diluição entre 1:1.000 e 1:10.000; d) lavagem das placas, após 15-60 minutos e 22-37°C, por 3 a 6 vezes com uma solução tampão, pH 7,0-7,4, seguida de adição, em cada poço, de 50 a 200 µl do reagente anti-Imunoglobulina G (Ig G) humana conjugado à biotina; e) incubação de 15-60 minutos e 22-37°C seguida de lavagem das placas por 3 a 6 vezes; f) adição, em cada poço, de 50 a 200 µl de estreptoavidina conjugada à peroxidase ou à fosfatase-alcalina e manutenção da temperatura das placas entre 22 a 37°C, por 15 a 60 minutos; g) lavagem das placas, após incubação, por 3 a 6 vezes seguida de adição de 50 a 200 µl/poço do reagente quimioluminescente; h) exposição das placas quimioluminescentes, após período de incubação e na ausência de luz, ao filme de raios-X, durante 3 a 10 minutos, a 22-37°C; i) revelação do filme, seguida de leitura em leitor de ELISA, em comprimento de onda de 490-500nm.