QUANTIFICAÇÃO DA HIBRIDIZAÇÃO DE SUSPENSÃO DE MICRO ESFERAS E USOS DAS MESMAS

IPC Classification

Abstract

QUANTIFICAÇÃO DA HIBRIDIZAÇÃO DE SUSPENSÃO DE MICROESFERAS E USOS DA MESMA. A presente invenção refere-se a novo ensaio de hibridização de suspensão que foi usado para a determinação de número de cópia de ácido nucléico através de citometria de fluxo. O ensaio foi validado com produtos de baixa cópia (lo) variando em comprimento a partir de 100 até 2304 pares de base conjugados a microesferas de polietileno epectralmente separadas. No exemplo provido aqui essas microesferas conjugadas foram usadas como sondas de hibridização multiplex para detectar seqúências homólogas em ONA genômico extraído a partir de péletes de células citogênicas e marcadas com biotina-dUTP. A hibridização foi detectada com estreptavidina marcada com ficoeritrina e analisada através de citometria de fluxo. As diferenças em número de cópia puderam ser distinguidas através da comparação das intensidades medias de fluorescência das sondas de teste com uma sonda de referência diplólde em DNA genômico de amostras de pacientes e linhas de células anormais. O ensaio é capaz de distinguir um único alelo e três alelos no local do teste a partir de uma seqúência bialélica de referência, sem levar em conta o contexto cromossômico. O ensaio é um aperfeiçoamento de métodos precedentes que requerem a amplificação antecipada do DNA-alvo específico para a localização, devido a que, as sondas 1c proporcionam uma especificidade e sensibilidade adequada para uma determinação, precisa do número da cópia de homólogos-alvo. Devido a sua elevada sensibilidade e precisão, o ensaio é útil para a determinação do número de cópia de um ácido nucléico com relação a uma variedade de aplicações, incluindo a determinação do número de cópia genômico em seres humanos, modelos animais de doenças e na solução, medição de níveis de transcritos, analise de DNA em medicina legal e analise de controle de qualidade na agricultura.