Processo de identificação de ligantes para receptores acoplados à proteína G contendo a expressão de RIC-8B e uso da proteína RIC-8B

IPC Classification

Abstract

Processo de identificação de ligantes para receptores acoplados à proteína G. A presente invenção refere-se a um processo de identificação de ligantes para receptores acoplados à proteínas G, em especial, para receptores protéicos presentes nos neurônios olfatórios do nariz, através da utilização de proteínas GEF (fatores trocadores de nucleotídeos de guanina), preferentemente a proteína RIC-8B, para permitir a seleção dos receptores olfatórios de acordo com as suas características intrísecas, quais sejam, receptores sensíveis a cheiros agradáveis, desagradáveis, doces azedos, suor, etc. Mais especificamente, o processo compreende as etapas de: a) cultivo de células HEK293 (linhagem imortalizada de células de rim de embrião humano) em placas de 96 poços, na densidade de 0,5 X 10^ 5^ células/poço; b) transfecção das células cerca de 24 h após o plaqueamento, com 10-30 ng de cada plasmídeo, de expressão contendo cDNAs correspondentes às regiões codificadoras de G olf, RIC-8B e o receptor olfatório a ser testado, da seguinte maneira: - mistura do DNA com 50 l de DMEM; - adição de l de PLUS REAGENT, misturar, incubar por 15 minutos à temperatura ambiente;- adição de 2 l de lipofectamina, que foi diluída em 50 l de DMEM, incubar por 15 minutos à temperatura ambiente; - aspiração do meio dos poços; - adição de 400 l de DMEM à mistura gentilmente, adicionar aos poços; - incubação por 3 horas a 37°C, 5% CO~ 2~; - adição de 3 ml de DMEM + 10% FBS; e - incubação de 24 a 48 h: c) adição a cada poço do ligante que será testado na concentração desejada, sendo as soluções estoque preparadas em DMSO e as diluições finais peparadas em DMEM sem soro, seguida de incubação por 10 minutos e adição de 200 l de tampão de lise; d) medição das concentrações de cAMP em cada poço.