MÉTODO PARA A AMPLIFICAÇÃO BASEADA EM TRANSCRIÇÃO DE UMA SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO ALVO PARTINDO DE DNA OPCIONALMENTE PRESENTE EM UMA AMOSTRA

Classificazione IPC

Rivendicazioni di priorità

Abstract

"MÉTODO PARA A AMPLIFICAÇÃO BASEADA EM TRANSCRIÇÃO DE UMA SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO ALVO PARTINDO DE DNA OPCIONALMENTE PRESENTE EM UMA AMOSTRA". A presente invenção refere-se a um método de amplificação baseada em transcrição para a amplificação de alvos de DNA partindo de dsDNA ou ssDNA opcionalmente presente em uma amostra, compreendendo as etapas de: - incubar a amostra em um tampão de amplificação com uma ou mais enzimas de restrição capazes de clivar DNA em um sítio de restrição selecionado, a citada enzima de restrição gerando uma extremidade 3 definida na(s) citada(s) fita(s) de DNA, e um promotor-iniciador, o citado promotor-iniciador possuindo uma região 5 compreendendo a seqüência de um promotor reconhecido por uma RNA-polimerase dependente de DNA e uma região 3 complementar à extremidade 3 definida da fita de DNA, um segundo iniciador, possuindo a polaridade oposta à do promotor-iniciador e compreendendo extremidade 5 da seqüência alvo, e no caso de ssDNA como o DNA alvo, um iniciador de restrição; - manter a mistura reacional assim formada sob as condições apropriadas por uma quantidade de tempo suficiente para a ocorrência de uma digestão pela enzima de restrição; submeter a amostra a um tratamento com calor em uma temperatura e por um tempo suficientes para inativar a enzima de restrição e/ou transformar uma fita dupla em fita simples; - adicionar os seguintes reagentes na amostra: uma enzima possuindo atividade de DNA-polimerase dependente de RNA, uma enzima possuindo atividade de DNA-polimerase dependente de DNA, uma enzima possuindo atividade de RNase H, uma enzima possuindo atividade de RNA-polimerase; e - manter a mistura reacional assim formada sob as condições apropriadas por uma quantidade de tempo suficiente para a ocorrência da amplificação.