MÉTODO IN VITRO PARA DETERMINAÇÃO DIRETA DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE UM POLIPEPTÍDEO

Classificazione IPC

Rivendicazioni di priorità

Abstract

MÉTODO PARA AUMENTAR A ABSORÇÃO ESPECÍFICA DE UM POLIPEPTÍDEO, MÉTODO PARA DETERMINAÇÃO DIRETA DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DE UM POLIPEPTÍDEO. A presente invenção fornece um método para melhorar a absorção específica de um polipeptídeo de neurotoxina nas células, método que compreende: a incubação das células suscetíveis à intoxicação por neurotoxina com um polipeptídeo de neurotoxina durante um tempo e sob condições que permitem que o polipeptídeo de neurotoxina exerça sua atividade biológica, sendo que a incubação compreende ao menos uma das etapas a seguir: (i) despolarização mediada por K+ das células, (ii) exposição durante um tempo reduzido ao polipeptídeo de neurotoxina e/ou (iii) agitação das células durante a exposição ao polipeptídeo de neurotoxina, aumentando, assim, a absorção específica do polipeptídeo de neurotoxina nas ditas células. Além disso, a presente invenção se refere a um método para determinar diretamente a atividade biológica de um polipeptídeo de neurotoxina nas células, que compreende: a) incubar as células suscetíveis à intoxicação por neurotoxina com um polipeptídeo de neurotoxina durante um tempo e sob condições que permitam que o polipeptídeo de neurotoxina exerça sua atividade biológica, sendo que a incubação compreende ao menos uma das etapas a seguir: (i) despolarização mediada por K+ das células, (ii) exposição durante um tempo reduzido ao polipeptídeo de neurotoxina e/ou (iii) agitação das células durante a exposição ao polipeptídeo de neurotoxina; b) fixar as células e, opcionalmente, permeabilizar as células com um detergente; c) colocar as células em contato com ao menos um primeiro anticorpo de captura que se liga especificamente ao substrato não clivado e clivado por neurotoxina e com ao menos um segundo anticorpo de captura que se liga especificamente ao sítio de clivagem do substrato clivado por neurotoxina, sob condições que permitam a ligação da dita captura de anticorpos aos ditos substratos; d) colocar as células em contato com ao menos um primeiro anticorpo de detecção que se liga especificamente ao primeiro anticorpo de captura, sob condições que permitam a ligação do dito primeiro anticorpo de detecção ao dito primeiro anticorpo de captura formando, assim, primeiros complexos de detecção, e com ao menos um segundo anticorpo de detecção que se liga especificamente ao segundo anticorpo de captura, sob condições que permitam a ligação do dito segundo anticorpo de detecção ao dito segundo anticorpo de captura formando, assim, segundos complexos de detecção; e) determinar a quantidade do primeiro e do segundo complexos de detecção da etapa d); e f) calcular a quantidade de substrato clivado pelo dito polipeptídeo de neurotoxina nas ditas células por meio dos segundos complexos de detecção determinando, assim, a atividade biológica do dito polipeptídeo de neurotoxina nas ditas células.