MÉTODO DE AMPLIFICAÇÃO DE MRNAS E PARA A PREPARAÇÃO DE BIBLIOTECAS DE MRNA DE COMPRIMENTO TOTAL

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Abstract

MÉTODO DE AMPLIFICAÇÃO DE MRNAS E PARA A PREPARAÇÃO DE BIBLIOTECAS DE MRNA DE COMPRIMENTO TOTAL.Um método para amplificar pelo menos um RNA que está contido em uma amostra inclui a transcrição reversa de pelo menos um RNA usando um primeiro iniciador, adicionando um didesoxinucleotídeo que é modificado na posição 3? com um primeiro parceiro de um par de moléculas de azida e de alquino por ação de uma polimerase independente de molde para ligar um único nucleotídeo didesóxi modificado 3?-azida ou 3?-alquino na extremidade 3? do cDNA obtido, adicionando uma molécula adaptadora que compreende uma sequência polinucleotídica e em sua extremidade 5? um segundo parceiro de tal par de moléculas de azida e alquino e ligando o adaptador ao cDNA modificado em 3? sob a formação de uma ligação triazol, adicionando um segundo iniciador que é complementar a pelo menos uma parte da molécula adaptadora e que contém em sua extremidade 3? um nucleotídeo que é complementar ao didesoxinucleotídeo na extremidade 3? do cDNA para efetuar a hibridização e a ligação do segundo iniciador que se sobrepõe à ligação triazol, adicionando um terceiro iniciador e amplificando o cDNA de comprimento total. Variações desse método também são descritas. Usos de tal método especialmente para preparar uma biblioteca de RNA de comprimento total e para sequenciamento de uma pluralidade de RNAs contidos em uma amostra, bem como kits de reagentes para realizar tais métodos.