MÉTODO DE SEQUENCIAMENTO DE UM ÁCIDO NUCLEICO E SISTEMA DE SONDA BIOLÓGICA MULTICOMPONENTE

IPC Classification

Priority claims

Abstract

Um método de sequenciamento de um ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (1) gerar uma corrente de nucleotídeos únicos por pirofosforólise progressiva do ácido nucleico; (2) produzir pelo menos uma sonda usada de oligonucleotídeo substancialmente de cadeia dupla por reação, na presença de uma polimerase e de uma ligase, de um dos nucleotídeos únicos com um sistema de sonda correspondente que compreende (a) um primeiro oligonucleotídeo de cadeia simples marcado com primeira e segunda regiões de tipos de elementos detectáveis característicos em um estado não detectável localizado respectivamente sobre os lados de extremidade X' e Y' de uma terceira região compreendendo um elemento de local de reconhecimento de enzima de restrição incluindo o local de captura e um local de bloqueio de exonuclease no seu lado X' (em que X' é 3' e Y' é 5' ou X' é 5' e Y' é 3') e (b) segundo e terceiro oligonucleotídeos de cadeia simples capazes de hibridizar com as regiões complementares no primeiro oligonucleotídeo que flanqueia o local de captura; (2a) ou (i) tratar a sonda usada com uma endonuclease de restrição dependente de substituição convencional ou cortante para cortar a primeira cadeia de oligonucleotídeos no local de reconhecimento se e apenas se o nucleotídeo único capturado compreender uma nucleobase que é substituída ou (ii) tratar a sonda usada com uma endonuclease de restrição sensível à substituição convencional ou cortante, para cortar a primeira cadeia de oligonucleotídeos no local de reconhecimento se e somente se o nucleotídeo único capturado compreender uma nucleobase que é não-substituída; (3) digerir a primeira cadeia oligonucleotídica da sonda utilizada com uma enzima possuindo atividade exonucleolítica de cadeia dupla na direção X'-Y' correspondente ao primeiro oligonucleotídeo para produzir elementos detectáveis derivados ou da primeira região, da segunda região, ou das primeira e segunda regiões em um estado detectável e um quarto oligonucleotídeo de cadeia simples que é pelo menos em parte o complemento de sequência do primeiro oligonucleotídeo; (4) reagir o quarto oligonucleotídeo com outro primeiro oligonucleotídeo para produzir um produto de oligonucleotídeo substancialmente de cadeia dupla correspondente à sonda usada; (5) repetir as etapas (2a), (3) e (4) em um ciclo e (6) detectar os elementos detectáveis liberados em cada iteração da etapa (3), em que se a endonuclease utilizada for do tipo convencional, o segundo ou o terceiro oligonucleotídeo inclui uma ligação direcionadora de endonucleólise em ou perto de sua extremidade X' ou Y' respectivamente.Sistemas de sonda biológica correspondentes também são divulgados.