PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES N-DEGLICOSILADAS IN VIVO POR CO-EXPRESSÃO COM ENDO H

IPC Classification

Abstract

Plantas têm surgido como um sistema de expressão alternativo e têm sido cada vez mais utilizadas pela indústria e comunidade acadêmica para a produção de proteínas alvo. Contudo, a habilidade de plantas para glicosilar proteínas pode ser uma limitação considerável para aquelas proteínas que não necessitam de N-glicolisação. Por exemplo, proteínas de Plasmodium falciparum ou uma cadeia A do fator humano XII não portam glicanos ligados ao N, assim como o antígeno protetor (PA) de Bacillus anthracis não porta uma glicoproteína; entretanto, essas proteínas contêm potenciais locais de glicosilação por ligação ao N que podem ser aberrantemente glicosilados durante a expressão em leveduras, em mamíferos ou sistemas de plantas, levando potencialmente a uma funcionalidade e imunogenicidade reduzidas por conta de enovelamento incorreto/alterado e/ou mascaramento de epítopos. Para superar esse problema, foi desenvolvida recentemente uma estratégia de deglicosilação enzimática de proteínas in vivo por co-expressão com PNGase F (Peptídeo: N-glicosidase F) com o uso de expressão transiente em plantas (WIPO Pedido de Patente WO/2012/170678), que permitiu a produção do candidato à vacina contra malária Pfs48/45, que pode fornecer uma alta atividade de bloqueio de transmissão (TB) (Mamedov et al., 2012). Adicionalmente, outros antígenos deglicosilados induziram significativamente altos níveis de respostas de anticorpos neutralizantes de toxinas em ratos em comparação com formas glicosiladas (Mamedov et al, manuscrito anexado). Apesar de um tratamento PNGase F (deglicosilação in vivo) remover oligossacarídeo intacto, também causa mudança no aminoácido na proteína deglicosilada devido à desaminação da asparagina (N) no local NxS/T (sequência) em um aspartato (D). Nesse estudo, uma estratégia foi desenvolvida para produção de proteínas alvo em plantas em formas não N-glicosiladas, mas sem nenhuma mudança de aminoácido no local NxS/T das proteínas deglicosiladas resultantes, as quais podem fornecer produção de proteínas recombinantes não N-glicosiladas em plantas ou outro sistema eucariótico com enovelamento como o nativo. Portanto, materiais e métodos para de-glicosilação in vivo de proteínas N-glicosiladas recombinantes por co-expressão com endo-N-acetil-ß-glicosaminidase H (Endo H) em plantas, com o uso de um sistema de expressão transiente, são descritos nesta invenção. Um método para expressar ativamente Endo H em plantas também é fornecido.