PROCESSO PARA CONSTRUÇÃO DE UM ÚNICO VETOR COMPREENDENDO CAS9 E SGRNA PARA MODIFICAÇÕES DO GENOMA DE MICOBACTÉRIAS

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Abstract

PROCESSO PARA CONSTRUÇÃO DE UM ÚNICO VETOR COMPREENDENDO CAS9 E SGRNA PARA MODIFICAÇÕES DO GENOMA DE MICOBACTÉRIAS. A presente invenção se refere a um processo para construção de um único vetor compreendendo cas9 e sgRNA (vetor tudo-em-um) para modificações do genoma de micobactérias, em que compreende as etapas de (a)sintetizar o cassete de expressão de cas9 e o cassete de expressão de tracrRNA com códons otimizados para a expressão emmicobactérias e clonar em um vetor de clonagem; (b) clonar sequencialmente as sequências otimizadas na etapa (a) em um vetor ponte micobacteriano; (c) selecionar as sequências de direcionamento (crRNAs) específicas para o gene de interesse; (d) inserir as crRNAs selecionadas na etapa (c) no vetor de expressão em micobactéria, a montante da sequência de tracrRNA, na posição +1 a jusante de um promotor indutível para a construção do cassete de sgRNA; e (e) adicionar no final de cada cassete de expressão um terminador de transcrição. Adicionalmente, a presente invenção se refere ao uso do vetor obtido conforme processo aqui descrito para a obtenção de cepas recombinantes auxotróficas complementadas com propriedades para induzir uma proteção contra M. tuberculosis.