MÉTODO DE DETECÇÃO DE DUPLAS FITAS DE RNA VIRAL UTILIZANDO ENZIMAS DO MECANISMOS DE RNA INTERFERENTE (RNAI)

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Abstract

A presente invenção trata de um novo tipo de teste molecular baseado no isolamento de duplas fitas de RNA (dsRNAs) produzidas durante a replicação viral em células infectadas e na utilização de enzimas do mecanismo de RNA interferente (RNAi). Dicer e Argonauta são enzimas-chave do mecanismo RNAi e podem ser utilizadas in vitro, em associação com sondas fluorigênicas, para detectar a presença de dsRNA viral de forma independente de transcrição reversa e amplificação por PCR. Este novo teste pode ser aplicado no diagnóstico de qualquer virose que produza quantidades elevadas de dsRNAs durante a fase de replicação do genoma viral. A ideia central é, ao invés de extrair moléculas de RNA de fita simples (ssRNAs) das células infectadas como é comum nos testes moleculares disponíveis, extrair dsRNAs que são muito mais resistentes à degradação por RNAses. Após a extração, estas dsRNAs serão expostas à ação do complexo Dicer-Argonauta2. As dsRNAs de origem viral serão, então, fragmentadas pela Dicer e os produtos desta degradação entregues à Argonauta2 na forma de pequenos fragmentos de ssRNA. Uma vez que a Argonauta2 esteja carregada com os ssRNAs, serão adicionadas à reação sondas de ssRNA marcadas com fluoróforos associados a repressores. Neste momento, pode-se usar uma ou diversas sondas desenhadas para diferentes genes de diferentes viroses, desde que cada sonda tenha um fluoróforo que emita fluorescência em comprimentos de onda diferentes. A fluorescência emitida poderá ser detectada em qualquer equipamento que detecte fluorescência em comprimentos de onda específicos. A utilização de diversas sondas em uma mesma reação poderá simplificar os protocolos de diagnóstico para positivos, assim como diminuir a carga de trabalho e economizar material quando comparado com as outras metodologias correntemente utilizadas.