LUCIFERASES DE VAGALUMES METAL E PH-SENSITIVAS MODIFICADAS E USO COMO REAGENTES E INDICADORES INTRACELULARES DE PH E METAIS PESADOS

IPC Classification

Abstract

LUCIFERASES DE VAGALUMES METAL E pH-SENSITIVAS MODIFICADAS E USO COMO REAGENTES E INDICADORES INTRACELULARES DE pH E METAIS PESADOS. Descreve três formas de mutantes simples, uma de duplo mutante e uma humanizada de lucíferases do vagalume Macrolampis sp2, desenvolvidas por meio da engenharia de sítios de ligação de prótons e dos metais zinco, níquel, cádmio e mercúrio, e sua utilização como reagentes analíticos bioluminescentes, genes repórteres bioluminescentes e como biossensores enzimáticos e intracelulares raciométricos de pH ou metais, através de mudanças espectrais da bioluminescência: a primeira forma da invenção consiste na luciferase Mac-N354H (SEQ ID no: 1 e SEQ ID no: 2), que responde com deslocamento espectral pronunciado na presença de níquel; a segunda forma, consiste na luciferase Mac-N354C (SEQ ID no: 1 e SEQ ID no: 2), cujo espectro é afetado principalmente por mercúrio e cádmio; a terceira forma consiste luciferase Mac-H310C (SEQ ID no: 1 e SEQ ID no: 2); a quarta forma com a dupla mutação é a Mac-H310C/N354C (SEQ ID no: 1 e SEQ ID no: 2), que apresenta propriedades funcionais diferenciadas, cujo espectro é afetado principalmente pela presença de mercúrio, chumbo e cádmio; também foi obtida uma quinta forma, a luciferase humanizada (SEQ ID no: 3), para expressão em células de mamíferos, por modificação de códons. Estas luciferases modificadas e seus cDNAs podem ser utilizadas como reagentes analíticos, como genes repórter, como biossensores intracelulares para medir variações de pH; como biossensores intracelulares para medir variações concentração de metais fisiológicos como Zinco, e como biossensores intracelulares para medir a concentração intracelular, biodisponibilidade e citotoxicidade de metais pesados como cádmio, chumbo e mercúrio em tempo real.